顯微成像小課堂丨透射光成像技術

來源: 锘海生物科學儀器(上海)股份有限公司   2019-8-27   訪問量:1343評論(0)

無論多么復雜的成像技術,都可以分為兩類。一類是透射光技術,也就是我們俗稱的明場或明視野,這里的明場其實是一個廣義的明場,具體又可以分為明場(Bright Field,BF);微分干涉對比(Differential Interference Contrast,DIC);霍夫曼調制對比(Hoffman Modulation Contrast,HMC);相差(Phase Contrast,PH);偏光(Polarized Light);暗場(Dark Field,DF)。另一類就是熒光技術。一些復雜的新穎的成像技術,例如光片顯微鏡,共聚焦顯微鏡,雙光子顯微鏡,都是基于熒光成像技術發展而來的。今天先介紹最基礎的透射光技術~~~


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明場顯微鏡和透射光技術

在過去的三個世紀里,在各種光學顯微鏡中使用的主要和最受歡迎的技術之一,明場照明,是依靠折射率或顏色的變化來產生對比度。當光通過樣品,物鏡收集和聚焦光線時,改變了波前的方向、速度、光譜的區域會產生光學差異(對比度)。明場系統的分辨率取決于物鏡和聚光鏡的數值孔徑,對于數值孔徑組合超過1的情況,通常需要在試樣的兩側使用浸沒介質。數碼相機提供了廣泛的動態范圍和所需的空間分辨率,以捕捉在明場圖像中存在的信息。此外,扣除光路中沒有樣本時的平均幀背景算法可以顯著增加對比度。

簡單的明場成像,通過適當調整顯微鏡的科勒照明,提供了關于細胞輪廓、核位置和較大囊泡位置的有限程度的信息(見圖2(a))。然而,明場模式中的對比度普遍不足,這使得該技術在對細胞結構和功能的深入研究時相對無用。增強對比度的方法包括微分干涉對比(DIC)、偏振光、相差、霍夫曼調制對比和暗場顯微鏡(示例如圖2所示)。一些技術受制于對較厚植物和動物組織成像時遠離焦平面的區域產生的光,而偏振光需要雙折射來產生對比度,通常在動物細胞中很大程度是不存在。圖2(a)所示的是中國倉鼠卵巢粘附細胞在無光學對比增強方法下的明場照明成像。與圖中的其他圖像相比,可以說基本沒有對比度。單個細胞很難區分,大多數內部特征(例如細胞核)在這張圖像中不可見。

微分干涉對比顯微鏡(圖2(b)和圖3(a))需要平面偏振光和附加的光剪切(Nomarski或Wollaston,所以有時DIC也會被稱為Nomarski DIC)棱鏡來放大樣品厚度梯度和折射率的微小差異。例如,由于細胞的水相和脂質相的折射率不同,脂質雙層在微分干涉對比中能產生很好的對比度。此外,相對平坦的貼壁哺乳動物細胞和植物細胞,包括質膜、核、液泡、線粒體和應激纖維的細胞邊界,通常會產生顯著的梯度,很容易用DIC成像。在植物組織中,雙折射細胞壁在一定程度上降低了DIC的對比度,但是一個校正得當的系統可以使得在表皮細胞中看到核膜、空泡膜、線粒體、葉綠體和濃縮染色體。


偏光顯微鏡(圖2(f)和圖3(b))是通過觀察正交偏振元件之間的樣品來進行的。細胞內具有雙折射特性的部分,如植物細胞壁、淀粉顆粒、有絲分裂紡錘體以及肌肉組織,旋轉光的偏振平面,使觀察的部分在黑暗背景下顯得明亮。圖2(f)所示的兔肌肉組織是應用偏光顯微鏡觀察活組織的一個例子。需要注意的是,這種技術受到活細胞和組織中少見的雙折射現象的限制。上面提到的微分干涉對比是通過在正交偏振器之間放置一對相對的Nomarski棱鏡來進行操作的,因此,任何配備了DIC觀測的顯微鏡也可以通過從光路中移除Nomarski棱鏡來檢查平面偏振光中的樣品。

使用最廣泛的相差技術(如圖2(c)和圖4(a)所示)采用光學機制將相位的微小變化轉化為相應的振幅變化,在視覺上的表現就是圖像對比度的差異。顯微鏡必須配備一個專門的聚光鏡,聚光鏡中包含一系列環形物與相差物鏡一一對應,相差物鏡在后焦平面中包含相差環(相差物鏡也可與熒光一起使用,但透射率略有降低)。對培養中的活細胞觀察或成像時,相差是一種很好的增強對比度的方法,但通常會導致邊緣特征輪廓周圍出現過多的光暈。這些光暈是光學偽影,通常會降低邊界細節的可見性。這項技術對于厚樣本(如植物和動物組織切片)用處不明顯,因為發生在遠離焦平面區域的相位偏移會扭曲圖像的細節。此外,漂浮的碎片和其他離焦的物體會干擾蓋片上粘附細胞的成像。

霍夫曼調制對比通常被比喻為“窮人的DIC”,它是一種斜照明技術,通過檢測光學相位梯度來增強活細胞和組織的對比度(見圖2(d)和圖4(b))。顯微鏡的基本結構包括一個光學振幅空間濾波器,稱為調制器,位于物鏡的后焦平面。通過調制器的光強在平均值的上下變化,根據定義,平均值被稱為調制。與物鏡調制器耦合的是一個離軸狹縫孔,該狹縫孔位于聚光鏡前焦平面內,用來將照明光傾斜指向樣品。與相差顯微鏡中的相位環板不同,霍夫曼調制器的設計不改變光通過的相位,而是影響主要的零級光的最大值以產生對比度。霍夫曼調制對比不受雙折射材料(如塑料培養皿)在光路中的使用的阻礙,因此該技術更適用于在聚合物材料制成的容器中檢測樣品。在缺點上,霍夫曼調制對比(HMC)產生了許多光學偽影,使該技術在某些方面不如用相差或DIC對在玻璃蓋片上活細胞成像有用。


圍繞暗場顯微鏡的方法,盡管在整個十九世紀和二十世紀廣泛應用于透明標本成像,但僅限于用于物理分離的細胞和生物體(如圖2(e)所示)。在這項技術中,聚光鏡在高方位角將一個光錐導向樣品,這樣一階波前就不會直接進入物鏡前透鏡元件。通過樣品的光被光學不連續性的(如細胞膜、細胞核和內部細胞器)衍射、反射和/或折射,使這些微弱的光線進入物鏡。然后,樣本可以在黑色背景上呈現為明亮的物體。不幸的是,從遠離焦平面上的物體散射的光也會對圖像產生影響,從而降低對比度并模糊樣品的細節。由于成像室中的灰塵和碎片對生成的圖像也有顯著影響,這一偽影更加復雜。此外,粘附的細胞很薄,信號很微弱,而厚的動植物組織會將太多的光引入物鏡光路中,從而降低了該技術的有效性。

以上介紹的就是幾種基本的用來增加對比度的方法,但是歸根結底,透射光技術有局限性,例如不可避免的光學偽影;另外,即使針對樣品選擇了最適合的觀察方法,但是僅僅在明暗上增加對比度的方法還是很難對活細胞進行更深入的研究。下節課我們將介紹熒光成像技術,這一技術的引入將對活細胞的研究帶入了一個全新的領域。



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